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- 2021/07/13
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## 目的基因的定义
1. 目的基因：主要指编码蛋白质的基因
2. 目的基因的获取方法
* 从**基因文库**中获取目的基因：不知道目的基因的核苷酸序列
* **人工合成**：已知基因序列，基因部分比较小
* 利用**PCR技术**扩增目的基因：基因序列部分或全部已知，基因部分比较大
## 基因文库
1. 定义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称之为基因文库。
2. 基因组文库含有一种生物的所有的基因，部分基因文库（如cDNA文库）只含有一种生物的部分基因
3. 建立基因文库的方法：
* 收集某种生物所有DNA，使用特定限制性内切酶切割，获得基因组所有基因
* 每个基因和运载体结合成重组DNA分子，之后导入受体菌，形成基因组文库
* 缺点：**工作量大，盲目性强**（更适用与原核生物，病毒等原核生物）
* CDNA文库：
* 建立cDNA文库方法：
* 提取生物的单链mRNA，通过反转录酶形成单链互补DNA
* 通过DNA聚合酶，生成双链cDNA片段，与载体连接
* 导入受体菌中储存，形成cDNA文库
* cDNA文库特点：不含有内含子和非编码区
|文库类型|cDNA文库|基因组文库|
|:----|:----|:----|
|文库大小|小|大|
|基因中启动子的有无|无|有|
|基因中内含子的有无|无|有|
|基因多少|某种生物的部分基因|某种生物的全部基因|
|物种间的基因交流|可以|部分基因可以|
## 从基因文库中获取目的基因
1. 核酸杂交技术：基因探针
* 基因探针即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。
* 可用同位素，生物素或荧光染料等标记
* 检测原理：碱基互补配对
2. 人工合成法：
* 反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后再酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因
* DNA合成酶合成目的基因（适用于已知目的基因的核苷酸序列）：已知氨基酸序列的蛋白质，推测出mRNA的核苷酸序列，推测出目的基因的核苷酸序列，化学合成出目的基因。（准确性较低）
## PCR扩增技术
* 定义：PCR是一项体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
* 适用范围：适用于核苷酸序列已知或部分已知的目的基因
* 条件：DNA模板，热稳定DNA聚合酶，能量物质（脱氧核苷三磷酸，dNTP），引物（长度在20-30dp，不能发生自身折叠，两条引物之间不能有两个以上的碱基互补配对）
* 过程：
|含有目的基因的DNA|
|:----|
|90~95℃变性|
|DNA单链|
|55~60℃复性|
|引物和互补单链DNA结合|
|70~75℃延伸|
|复制出新的DNA分子|
|经过n个循环|
|2的n次方个DNA分子|
* 由于CG含有三个氢键，AT只含有两个氢键。所以CG含量高，复性温度也高
* 在第三轮就可以获得所需要的DNA。
* 检验方法：电泳技术
| | |PCR扩增技术|DNA复制|
|:----|:----|:----|:----|
|相同点|条件|脱氧核苷酸，能量，模板，酶| |
| |原理|半复制保留| |
| 不同点|解旋方式|高温下变形全部解旋|解旋酶催化，边解旋边复制|
| |场所|体外复制（30多次）|主要细胞内|
| |酶|热稳定的DNA聚合酶|细胞内的DNA聚合酶|
| |结果|大量的DNA片段| |
##
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